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琼脂糖凝胶4B分离方法
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发布日期：2017/11/28 9:33:57
更新日期：2019/11/22 17:01:48
详细内容
琼脂糖凝胶4B分离方法产品简介：
中文名： 琼脂糖凝胶4B
英文名：Sepharose 4B
供应商：上海远慕
规格：100ml/500ml
颗粒大小：45-165um
适用范围：科研，实验
琼脂糖凝胶4B说明：
1. 琼脂糖凝胶4B是一种层析介质，sapharose 4B用4%琼脂糖凝胶制用于筛层析用作制备亲层析介质基本骨架。
2.琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
2.柱子尽可能长，葡聚糖凝胶柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。
3.馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。
4.鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。
5.葡聚糖凝胶对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
6.填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。暂时不用试可以水洗→含水醇洗（醇的浓度逐步递增）→醇洗，后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙迷洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80°C干燥后保存。
琼脂糖凝胶4B注意事项：
1.该凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产生气泡影响柱效。
2.吸附：10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，其中含有0.2MNaCl，2mMMnCl2，2mMCaCl2。平衡10个柱子床体积。
3.洗脱：可以用pH4.5-6的缓冲液洗脱，也可以用100-500mM糖类竞争线性或阶段洗脱，例如用甲基葡萄糖等甲基吡喃糖，其中缓冲液可以是10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，含有0.2MNaCl.洗脱多可以到10个柱床体积。
4.上样样品必须与平衡柱子的缓冲液pH、电导相同。
5.ConA琼脂糖凝胶FF亲和填料的再生处理方法：先用0.1MTris-HClpH8.5缓冲液洗含0.2MNaCl洗10个柱床体积，然后用20mM醋酸缓冲液，pH4.5洗3个床体积,后用20%乙醇洗3个床体积即可。
6.对于吸附力强的物质可以用0.1M硼酸盐缓冲液，pH6.5低流速洗3-5个柱床体积。也可以用乙醇线性洗脱20-50%。
7.该亲和填料保存条件为20%乙醇，+4~8℃。
琼脂糖凝胶4B配制流程：
2.熔胶 将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。
3.倒胶 干净的胶槽内摆好梳子，往胶内滴加1uL左右核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。
4.拔梳.待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的TBE缓冲液）。
标签： 琼脂糖凝胶4B分离方法
中文名： 琼脂糖凝胶4B
英文名：Sepharose 4B
供应商：上海远慕
规格：100ml/500ml
颗粒大小：45-165um
适用范围：科研，实验
琼脂糖凝胶4B说明：
1. 琼脂糖凝胶4B是一种层析介质，sapharose 4B用4%琼脂糖凝胶制用于筛层析用作制备亲层析介质基本骨架。
2.琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构，网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下，它的结构是稳定的，可以在许多条件下使用（如水，pH4-9范围内的盐溶液）。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化，也不能高压消毒，可用化学灭菌活处理。
琼脂糖凝胶4B分离方法：
1. 分离时流速不可太快，切切不可心急，所谓欲速则不达；接馏分时可开全速，节省时间。
2.柱子尽可能长，葡聚糖凝胶柱长的增加将极大地改善分离，所不要吝惜填料，宁可将填料全装在一根大柱子中，不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力，打击敌人。
3.馏分一定要接的细，可1/10，或1/20 个保留体积接成一馏分。
4.鞣质成分死吸附严重，如不在乎填料者，可用Sephadex LH20 分鞣质。
5.葡聚糖凝胶对黄酮类成分的分离效果极佳，方法很成型，有大量文献参考。
6.填料反复使用，每次用完，一般可用甲醇将柱子洗干净，然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来，待用。暂时不用试可以水洗→含水醇洗（醇的浓度逐步递增）→醇洗，后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时，可在以上处理基础上，减压抽干，再用少量乙迷洗净抽干，室温充分挥散至无醚味后，60～80°C干燥后保存。
琼脂糖凝胶4B操作流程：
1.乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;
2.无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；
3.盐酸浸泡：在常温下再用0.2NHCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；
4.将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；
5.上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；
6.凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可；
7.洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；
8.在位清洗（CIP）凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
1.乙醇浸泡：在室温下，将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时，并不断搅拌以保证凝胶溶胀，用无盐水洗去残存的乙醇滤干;
2.无盐水浸泡：室温下，在无盐水中充分溶胀24小时，间隙搅拌，以保证凝胶的完全溶胀，然后；
3.盐酸浸泡：在常温下再用0.2NHCl浸泡12小时，间隙搅拌，滤干，水洗只中性；
4.将溶胀好的凝胶脱气后（真空抽滤或超声波）根据装柱要求一次性置入柱内，注意保持湿态装柱，并避免柱内产生气泡或断层；
5.上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止（流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值）；
6.凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积，我们建议初次上样控制在1-2%的床体积，视分离情况可以调整；脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积，柱高的选择也与分离要求相关，柱高控制在40-50cm以下，过高的凝胶层会引起较大的反压，应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制，脱盐时高径比为5：1即可；
7.洗脱方法：可以用无盐水，也可以采用上柱时的缓冲液洗脱；在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化；
8.在位清洗（CIP）凝胶使用十次后作一次CIP，目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积，再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。
琼脂糖凝胶4B注意事项：
1.该凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温，然后再装柱，以免产生气泡影响柱效。
2.吸附：10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，其中含有0.2MNaCl，2mMMnCl2，2mMCaCl2。平衡10个柱子床体积。
3.洗脱：可以用pH4.5-6的缓冲液洗脱，也可以用100-500mM糖类竞争线性或阶段洗脱，例如用甲基葡萄糖等甲基吡喃糖，其中缓冲液可以是10-30Tris-HCl缓冲液，pH7.5，含有0.2MNaCl.洗脱多可以到10个柱床体积。
4.上样样品必须与平衡柱子的缓冲液pH、电导相同。
5.ConA琼脂糖凝胶FF亲和填料的再生处理方法：先用0.1MTris-HClpH8.5缓冲液洗含0.2MNaCl洗10个柱床体积，然后用20mM醋酸缓冲液，pH4.5洗3个床体积,后用20%乙醇洗3个床体积即可。
6.对于吸附力强的物质可以用0.1M硼酸盐缓冲液，pH6.5低流速洗3-5个柱床体积。也可以用乙醇线性洗脱20-50%。
7.该亲和填料保存条件为20%乙醇，+4~8℃。
琼脂糖凝胶4B配制流程：
a,称量、b,熔胶、c,倒胶、d,拔梳。
1.称量 我们通常所说的0.8%、1%的胶都是指的质量体积分数，即所称取的琼脂糖粉的质量（g）比所加的TBE缓冲液的体积（mL）即胶的浓度。缓冲液的体积根据胶板的大小而定。如小胶板0.8%的胶需要琼脂粉0.104g，TBE13mL。
2.熔胶 将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合，在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。
3.倒胶 干净的胶槽内摆好梳子，往胶内滴加1uL左右核酸染料，混匀，待冷却至不烫手，轻轻倒入胶板内。
4.拔梳.待大约20min后，轻轻拔掉梳子（若不好拔，可以滴加适量的TBE缓冲液）。
标签： 琼脂糖凝胶4B分离方法
