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上海远慕生物科技有限公司

产品介绍

琼脂糖凝胶4B分离方法

价 格:¥电议

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产品完善度:

生产地:其他访问量:140次

发布日期:2017/11/28 (更新日期:2019/10/18)

详细内容

 琼脂糖凝胶4B分离方法产品简介:


中文名:
 琼脂糖凝胶4B

英文名:Sepharose 4B


供应商:上海远慕

规格:100ml/500ml

颗粒大小:45-165um

适用范围:科研,实验
琼脂糖凝胶4B分离方法

 琼脂糖凝胶4B说明

1. 琼脂糖凝胶4B是一种层析介质,sapharose 4B用4%琼脂糖凝胶制用于筛层析用作制备亲层析介质基本骨架。

2.琼脂糖凝胶是依靠糖链之间的次级链如氢键来维持网状结构,网状结构的疏密依靠琼脂糖的浓度。一般情况下,它的结构是稳定的,可以在许多条件下使用(如水,pH4-9范围内的盐溶液)。琼脂糖凝胶在40℃以上开始融化,也不能高压消毒,可用化学灭菌活处理。



 琼脂糖凝胶4B分离方法
 
1. 分离时流速不可太快,切切不可心急,所谓欲速则不达;接馏分时可开全速,节省时间。

2.柱子尽可能长,葡聚糖凝胶柱长的增加将极大地改善分离,所不要吝惜填料,宁可将填料全装在一根大柱子中,不要将填料装成几根小柱。所谓集中优势兵力,打击敌人。

3.馏分一定要接的细,可1/10,或1/20 个保留体积接成一馏分。

4.鞣质成分死吸附严重,如不在乎填料者,可用Sephadex LH20 分鞣质。

5.葡聚糖凝胶对黄酮类成分的分离效果极佳,方法很成型,有大量文献参考。

6.填料反复使用,每次用完,一般可用甲醇将柱子洗干净,然后用下一次分离的起步溶剂将甲醇替换出来,待用。暂时不用试可以水洗→含水醇洗(醇的浓度逐步递增)→醇洗,后泡在醇中贮于磨口瓶中备用。如长期不用时,可在以上处理基础上,减压抽干,再用少量乙迷洗净抽干,室温充分挥散至无醚味后,60~80°C干燥后保存。


 
 琼脂糖凝胶4B操作流程:

1.乙醇浸泡:在室温下,将干粉浸泡于50-60%乙醇中至少24小时,并不断搅拌以保证凝胶溶胀,用无盐水洗去残存的乙醇滤干;

2.无盐水浸泡:室温下,在无盐水中充分溶胀24小时,间隙搅拌,以保证凝胶的完全溶胀,然后;

3.盐酸浸泡:在常温下再用0.2NHCl浸泡12小时,间隙搅拌,滤干,水洗只中性;

4.将溶胀好的凝胶脱气后(真空抽滤或超声波)根据装柱要求一次性置入柱内,注意保持湿态装柱,并避免柱内产生气泡或断层;

5.上样前平衡层析柱至少3-5个柱体积直到记录仪基线变得平稳为止(流出液的PH值等于上柱的Buffer的PH值);

6.凝胶过滤的上样量一般为5%的柱床体积,我们建议初次上样控制在1-2%的床体积,视分离情况可以调整;脱盐时上样量可以达到20%的柱床体积,柱高的选择也与分离要求相关,柱高控制在40-50cm以下,过高的凝胶层会引起较大的反压,应当尽可能避免。难分离物质要有一定柱高和流速控制,脱盐时高径比为5:1即可;

7.洗脱方法:可以用无盐水,也可以采用上柱时的缓冲液洗脱;在上柱Buffer中加入NaCl等梯度洗脱或盐梯度洗脱也可以完全分离纯化;

8.在位清洗(CIP)凝胶使用十次后作一次CIP,目的是去除柱床内沉淀的及顽固残留的蛋白。方法是以40cm/h用1M氢氧化钠反向洗四个柱体积,再以至少三个柱体积平衡缓冲液再生。



 琼脂糖凝胶4B注意事项:

1.该凝胶从冷室或冰箱中取出后在室温下缓慢振摇恢复到室温,然后再装柱,以免产生气泡影响柱效。

2.吸附:10-30Tris-HCl缓冲液,pH7.5,其中含有0.2MNaCl,2mMMnCl2,2mMCaCl2。平衡10个柱子床体积。

3.洗脱:可以用pH4.5-6的缓冲液洗脱,也可以用100-500mM糖类竞争线性或阶段洗脱,例如用甲基葡萄糖等甲基吡喃糖,其中缓冲液可以是10-30Tris-HCl缓冲液,pH7.5,含有0.2MNaCl.洗脱多可以到10个柱床体积。

4.上样样品必须与平衡柱子的缓冲液pH、电导相同。

5.ConA琼脂糖凝胶FF亲和填料的再生处理方法:先用0.1MTris-HClpH8.5缓冲液洗含0.2MNaCl洗10个柱床体积,然后用20mM醋酸缓冲液,pH4.5洗3个床体积,后用20%乙醇洗3个床体积即可。

6.对于吸附力强的物质可以用0.1M硼酸盐缓冲液,pH6.5低流速洗3-5个柱床体积。也可以用乙醇线性洗脱20-50%。

7.该亲和填料保存条件为20%乙醇,+4~8℃。







 琼脂糖凝胶4B配制流程:

a,称量、b,熔胶、c,倒胶、d,拔梳。
 
1.称量 我们通常所说的0.8%、1%的胶都是指的质量体积分数,即所称取的琼脂糖粉的质量(g)比所加的TBE缓冲液的体积(mL)即胶的浓度。缓冲液的体积根据胶板的大小而定。如小胶板0.8%的胶需要琼脂粉0.104g,TBE13mL。

2.熔胶 将所称量的琼脂粉与TBE在锥形瓶中混合,在微波炉内反复加热2~3次至琼脂粉溶解并无气泡。

3.倒胶 干净的胶槽内摆好梳子,往胶内滴加1uL左右核酸染料,混匀,待冷却至不烫手,轻轻倒入胶板内。

4.拔梳.待大约20min后,轻轻拔掉梳子(若不好拔,可以滴加适量的TBE缓冲液)。



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