组织MDA测定实验方法

一、原理与意义

原理：过氧化脂质降解产物中的丙二醛（Malondialdehyde, MDA）可与硫代巴比妥酸（Thiobarbituric acid, TBA）缩合，形成红色产物硫代巴比妥酸反应物（Thiobarbituric acid-reactive substance, TBARS），在532nm处有最大吸收峰。

意义：机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基，后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用，使组织细胞受损伤，并由此形成脂质过氧化物，如：MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。

二、仪器

可见光分光光度计，95℃水浴锅（或普通铝锅开盖煮沸），低速离心机。7ml塑料试管。

三、试剂

试剂盒组成配置如下（50T和100T）：

50T试剂盒组成与配制：

① 试剂一：液体10 ml×1瓶，室温保存。（缓冲液，天冷时会凝固，每次使用前应37℃水浴适当加温，直至透明）；

② 试剂二：液体6 ml×1瓶，用时加170 ml双蒸水混匀，4℃冷藏；（缓冲液，勿接触皮肤）

③ 试剂三：粉剂×1瓶，用时将粉剂加到90℃～100℃的热双蒸水30 ml中，（溶解过程中适当加热），充分溶解后用双蒸水补足30ml再加冰醋酸30ml，混匀，避光冷藏；（冰醋酸自备）

④ 标准品：10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶，4℃冷藏。

100T试剂盒组成与配制：

① 试剂一：液体20 ml×1瓶，室温保存。（缓冲液，天冷时会凝固，每次使用前应37℃水浴适当加温，直至透明）；

② 试剂二：液体12 ml×1瓶，用时加340 ml双蒸水混匀，4℃冷藏；（缓冲液，勿接触皮肤）

③ 试剂三：粉剂×1瓶，用时将粉剂加到95℃～100℃的热双蒸水60 ml中，（溶解过程中适当加热），充分溶解后用双蒸水补足60ml再加冰醋酸30ml，混匀，避光冷藏；（冰醋酸自备）

④ 标准品：10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶，4℃冷藏。

[注]：冰醋酸又名乙酸，一般医药公司有售，要分析纯级（即AR级，乙酸含量为99％以上）

四、步骤

1、操作表如下

上述混合液混匀，盖紧，于95℃～100℃水浴锅内反应40～60 min（反应时间因MDA含量高低而异，MDA含量低时，时间可相应延长，但每次需一致）      取出后流水冷却，在4000转/分中离心10 min，取上清***，532 nm波长，蒸馏水调零比色。（注：a*，表示所取标准品、无水乙醇、测试样品和试剂一的量，四者均相等，10％的肝脏组织匀浆一般取0.1 ml；**，一般标准管、标准空白管和测定空白管每批只需做1～2个，蛋白不高时，测定空白管可用标准空白管代替；***，吸取上清时尽量小心，避免吸到底下沉淀）

五、结果计算与评价

1、计算公式：

① 血清（浆）中MDA含量计算公式：

② 组织中MDA含量计算公式：

﹡nmol/mg prot为纳摩尔/毫克蛋白

六、注意事项

         ①      天冷时试剂一会凝固，须水浴加热至透明方可使用；

         ②      匀浆样品不宜保存，需当天测试；

         ③      样品应冰上匀浆（低温操作）；

         ④      反应后离心沉淀要充分，比色时注意不要将沉淀倒入杯中，否则结果偏高；

         ⑤      标准管吸光度减去标准空白管吸光度的值在0.065～0.070之间；

         ⑥      本试剂盒4℃避光保存1年。