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发布时间:2016/3/16点击次数:3362
一、原理与意义
原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)可与硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid, TBA)缩合,形成红色产物硫代巴比妥酸反应物(Thiobarbituric acid-reactive substance, TBARS),在532nm处有最大吸收峰。
意义:机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用,使组织细胞受损伤,并由此形成脂质过氧化物,如:MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。
二、仪器
可见光分光光度计,95℃水浴锅(或普通铝锅开盖煮沸),低速离心机。7ml塑料试管。
三、试剂
试剂盒组成配置如下(50T和100T):
50T试剂盒组成与配制:
① 试剂一:液体10 ml×1瓶,室温保存。(缓冲液,天冷时会凝固,每次使用前应37℃水浴适当加温,直至透明);
② 试剂二:液体6 ml×1瓶,用时加170 ml双蒸水混匀,4℃冷藏;(缓冲液,勿接触皮肤)
③ 试剂三:粉剂×1瓶,用时将粉剂加到90℃~100℃的热双蒸水30 ml中,(溶解过程中适当加热),充分溶解后用双蒸水补足30ml再加冰醋酸30ml,混匀,避光冷藏;(冰醋酸自备)
④ 标准品:10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶,4℃冷藏。
100T试剂盒组成与配制:
① 试剂一:液体20 ml×1瓶,室温保存。(缓冲液,天冷时会凝固,每次使用前应37℃水浴适当加温,直至透明);
② 试剂二:液体12 ml×1瓶,用时加340 ml双蒸水混匀,4℃冷藏;(缓冲液,勿接触皮肤)
③ 试剂三:粉剂×1瓶,用时将粉剂加到95℃~100℃的热双蒸水60 ml中,(溶解过程中适当加热),充分溶解后用双蒸水补足60ml再加冰醋酸30ml,混匀,避光冷藏;(冰醋酸自备)
④ 标准品:10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶,4℃冷藏。
[注]:冰醋酸又名乙酸,一般医药公司有售,要分析纯级(即AR级,乙酸含量为99%以上)
四、步骤
1、操作表如下
| 标准管 | 标准空白管 | 测定管 | 测定空白管** |
10 nmol/ml标准品(ml) | a* |
|
|
|
无水乙醇(ml) |
| a* |
|
|
测试样品(ml) |
|
| a* | a* |
试剂一(ml) | a* | a* | a* | a* |
混匀(摇动几下试管架) | ||||
试剂二(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
试剂三(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
|
50%冰醋酸(ml) |
|
|
| 1.5 |
上述混合液混匀,盖紧,于95℃~100℃水浴锅内反应40~60 min(反应时间因MDA含量高低而异,MDA含量低时,时间可相应延长,但每次需一致) 取出后流水冷却,在4000转/分中离心10 min,取上清***,532 nm波长,蒸馏水调零比色。(注:a*,表示所取标准品、无水乙醇、测试样品和试剂一的量,四者均相等,10%的肝脏组织匀浆一般取0.1 ml;**,一般标准管、标准空白管和测定空白管每批只需做1~2个,蛋白不高时,测定空白管可用标准空白管代替;***,吸取上清时尽量小心,避免吸到底下沉淀)
五、结果计算与评价
1、计算公式:
① 血清(浆)中MDA含量计算公式:
血清(浆)中MDA含量 | = | 测定管OD-测定空白管OD | × | 标准品浓度 | × | 样品测试前 |
(nmol/ml) | 标准管OD-标准空白管OD | (10nmol/ml) | 稀释倍数 |
② 组织中MDA含量计算公式:
组织中MDA含量 | = | 测定管OD-测定空白管OD | × | 标准品浓度 | ÷ | 蛋白含量 |
(nmol/mg prot﹡) | 标准管OD-标准空白管OD | (10nmol/ml) | (mg prot/ml) |
﹡nmol/mg prot为纳摩尔/毫克蛋白
六、注意事项
① 天冷时试剂一会凝固,须水浴加热至透明方可使用;
② 匀浆样品不宜保存,需当天测试;
③ 样品应冰上匀浆(低温操作);
④ 反应后离心沉淀要充分,比色时注意不要将沉淀倒入杯中,否则结果偏高;
⑤ 标准管吸光度减去标准空白管吸光度的值在0.065~0.070之间;
⑥ 本试剂盒4℃避光保存1年。
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