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MDA含量检测方法说明

发布时间:2016/3/16点击次数:2577

                                                                  组织MDA测定实验方法

一、原理与意义

原理:过氧化脂质降解产物中的丙二醛(Malondialdehyde, MDA)可与硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid, TBA)缩合,形成红色产物硫代巴比妥酸反应物(Thiobarbituric acid-reactive substance, TBARS,在532nm处有最大吸收峰。

意义:机体通过酶系统和非酶系统产生氧自由基,后者能攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸引发脂质过氧化作用,使组织细胞受损伤,并由此形成脂质过氧化物,如:MDA等。MDA的高低间接反应机体细胞的氧化损伤程度。

二、仪器

可见光分光光度计,95℃水浴锅(或普通铝锅开盖煮沸),低速离心机。7ml塑料试管。

三、试剂

试剂盒组成配置如下(50T100T):

50T试剂盒组成与配制:

① 试剂一:液体10 ml×1瓶,室温保存。(缓冲液,天冷时会凝固,每次使用前应37℃水浴适当加温,直至透明);

② 试剂二:液体6 ml×1瓶,用时加170 ml双蒸水混匀,4℃冷藏;(缓冲液,勿接触皮肤)

③ 试剂三:粉剂×1瓶,用时将粉剂加到90℃100℃的热双蒸水30 ml中,(溶解过程中适当加热),充分溶解后用双蒸水补足30ml再加冰醋酸30ml,混匀,避光冷藏;(冰醋酸自备)

④ 标准品:10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶,4℃冷藏。

100T试剂盒组成与配制:

① 试剂一:液体20 ml×1瓶,室温保存。(缓冲液,天冷时会凝固,每次使用前应37℃水浴适当加温,直至透明);

② 试剂二:液体12 ml×1瓶,用时加340 ml双蒸水混匀,4℃冷藏;(缓冲液,勿接触皮肤)

③ 试剂三:粉剂×1瓶,用时将粉剂加到95℃100℃的热双蒸水60 ml中,(溶解过程中适当加热),充分溶解后用双蒸水补足60ml再加冰醋酸30ml,混匀,避光冷藏;(冰醋酸自备)

④ 标准品:10 nmol/ml四乙氧基丙烷5 ml×1瓶,4℃冷藏。

[]冰醋酸又名乙酸,一般医药公司有售,要分析纯级(即AR级,乙酸含量为99%以上)

四、步骤

1、操作表如下

 

标准管

标准空白管

测定管

测定空白管**

10 nmol/ml标准品(ml

a*

 

 

 

无水乙醇(ml

 

a*

 

 

测试样品(ml

 

 

a*

a*

试剂一(ml

a*

a*

a*

a*

混匀(摇动几下试管架)

试剂二(ml

1.5

1.5

1.5

1.5

试剂三(ml

1.5

1.5

1.5

 

50%冰醋酸(ml

 

 

 

1.5

上述混合液混匀,盖紧,于95℃100℃水浴锅内反应4060 min(反应时间因MDA含量高低而异,MDA含量低时,时间可相应延长,但每次需一致)      取出后流水冷却,在4000/分中离心10 min,取上清***532 nm波长,蒸馏水调零比色。(注:a*,表示所取标准品、无水乙醇、测试样品和试剂一的量,四者均相等,10%的肝脏组织匀浆一般取0.1 ml**,一般标准管、标准空白管和测定空白管每批只需做12个,蛋白不高时,测定空白管可用标准空白管代替***,吸取上清时尽量小心,避免吸到底下沉淀

五、结果计算与评价

1、计算公式:

血清(浆)中MDA含量计算公式:

血清(浆)中MDA含量

测定管OD-测定空白管OD

×

标准品浓度

×

样品测试前

nmol/ml

标准管OD-标准空白管OD

10nmol/ml

稀释倍数

组织中MDA含量计算公式:

组织中MDA含量

测定管OD-测定空白管OD

×

标准品浓度

÷

蛋白含量

nmol/mg prot﹡)

标准管OD-标准空白管OD

10nmol/ml

mg prot/ml

nmol/mg prot为纳摩尔/毫克蛋白

六、注意事项

               天冷时试剂一会凝固,须水浴加热至透明方可使用;

               匀浆样品不宜保存,需当天测试;

               样品应冰上匀浆(低温操作);

               反应后离心沉淀要充分,比色时注意不要将沉淀倒入杯中,否则结果偏高;

               标准管吸光度减去标准空白管吸光度的值在0.0650.070之间;

               本试剂盒4避光保存1

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