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基于体外细胞培养和模型的化妆品抗衰老功效评价

发布时间：2021/1/5点击次数：193

本文要点：角质形成细胞、成纤维细胞及相关模型与抗衰老功效评价

皮肤衰老的特征指标

衰老细胞发生的变化：细胞形态变大，扁平;衰老相关的β-半乳糖苷酶(SA-β-gal) 活性增强;p16上调;lamin B1表达减少;HMGB1核移位至细胞质和细胞外液;衰老相关分泌表型(SASP)的分泌，包括炎症细胞因子和金属蛋白酶......

SASP由促炎细胞因子、生长因子、趋化因子和基质重塑酶等一系列细胞因子组成，它们可以导致机体慢性低度炎症和疾病，并可以反作用于衰老细胞及其邻近细胞加速它们的衰老进程，并可作为新的细胞衰老效应机制。

图1 年轻和衰老皮肤示意图

(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)

图2 与皮肤衰老相关的生物指标

(Biomarkers of Cellular Senescence ａnd Skin Aging,2018)

基于人皮肤角质形成细胞的抗衰老功效评估

人表皮中的主体细胞成分是角质形成细胞，此类细胞经过增殖和分化，最终形成包括基底层、棘层、粒层及角质层的表皮复层结构。人角质形成细胞是表皮中重要的细胞，也是紫外线敏感的靶细胞。近年来研究表明，人角质形成细胞在光老化的发生和发展中起重要作用，在加重炎症反应方面也尤为突出。

图3 炎症因子含量随着紫外照射剂量的增加而增加

紫外线可活化Rel家族中的核因子κB，导致细胞因子、黏附分子以及一氧化氮合成酶和环氧化酶等炎症性酶类合成。促炎性细胞因子包括白细胞介素（IL）1β、IL⁃6、IL⁃8和肿瘤坏死因子TNF-α等。上述细胞因子又可通过促进活化蛋白1和核因子κB途径，放大皮肤对UV照射的反应。

人皮肤永生化角质细胞 HaCaT是非肿瘤来源的人正常皮肤角质形成永生化细胞株，较易于培养及传代。目前 HaCaT细胞株已被广泛应用于化妆品的抗衰老及透皮性的研究中。

在 Zöller 等的一项体外研究中，比较了培养基中添加温泉水（理肤泉、雅漾）和饮用天然矿泉水（heppinger、adelholzener）对人角质形成细胞生理参数的影响。结果表明，温泉水被 UV 刺激后产生活性氧，用酶联免疫吸附试验和启动子的转录测定，发现可反转IL⁃6的诱导；天然矿泉水也能对上述炎性因子产生影响，但程度较轻。

成纤维细胞的抗衰老功效评估

人皮肤成纤维细胞(Human skin fibroblasts, HSF)是人体皮肤真皮中的主体细胞，具有合成和分泌胶原纤维、弹性纤维及其他机质成分的功能，这些成分和成纤维细胞共同维持真皮层的弹性。

图4 成纤维细胞在自然老化和光老化中的区别

研究人员证实，自然老化皮肤的胶原降低是由于成纤维细胞合成胶原减少，分泌的基质金属蛋白酶(MMP-1，MMP-2)增加，而光老化皮肤的胶原减少主要是成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶增加，胶原合成下降不明显。由此可见成纤维细胞的胶原代谢在自然老化和光老化之间有一定差别。

1 体外增殖能力检测

成纤维细胞除了分泌胶原纤维、弹性纤维维持皮肤弹性之外，还有趋化性和粘附性，对维持皮肤的弹性和韧性具有重要作用，HSF的数量减少是引起皱纹产生的重要原因。

真皮中成纤维细胞的数量及活力均会影响胶原蛋白的分泌、胶原蛋白纤维的数量以及胶原蛋白纤维束构造。成纤维细胞生长因子是其增殖最有效的刺激因子，可以作为实验的阳性对照，评价化妆品是否有效刺激成纤维细胞增殖。

图5 基于成纤维细胞的样品增殖效果测试

2 胶原含量检测

胶原蛋白是细胞外基质中最活跃的成分之一，是创面愈合和瘢痕形成的关键因素，在皮肤功能修复中起重要作用。正常成人皮肤中HSF分泌的胶原主要以Ⅰ和Ⅲ 型为主。其中Ⅰ型胶原是构成正常成人皮肤的主体，而正常胎儿皮肤主要由Ⅲ型胶原组成。

胶原含量的测定有多种方法，通过ELISA 法和western Blot和免疫荧光等方法可分别精确定量体外培养的HSF分泌及细胞本身胶原含量的变化。

图6 基于成纤维细胞的胶原蛋白定量检测（免疫荧光法；来自博溪生物）

3 抗氧化功效检测

正常人体细胞每天生化代谢产生大量的ROS。细胞中过氧化物酶发挥了清除ROS的功能，起抗氧化作用。其中超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）在自由基生成的起始阶段发挥预防性作用，而谷胱甘肽过氧化物酶（GSH- Px）发挥抗脂质过氧化作用。

通过流式细胞术直接检测 HSF内ROS水平的改变、通过比色法检测SOD，CAT 和GSH-Px等酶活性的变化，均能灵敏反映出化妆品抗氧化功效。

4 其他衰老相关生物指标检测

衰老细胞通常体积变大，溶酶体衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）酶活性增高。采用免疫组化法观察β-半乳糖苷酶染色细胞的颜色变化以及用比色法定量β-半乳糖苷酶活性，可以评估HSF衰老程度的变化。

丙二醛（MDA）是脂质过氧化重要产物，在衰老过程中显著累积，与皮肤老年斑（褐脂质）含量呈正相关。目前ＭＤA被认为是一种重要的衰老生物标记物，通过ELISA法检测MDA含量变化是比较灵敏的HSF老化评价方法。

5 案例展示

Wang等发现紫外线辐照后成纤维细胞中 SA-β-gal 活性增强，作为衰老的生物标志物之一，表明 UVB 照射诱导细胞进入衰老状态;同时观察到染料木素能有效地抑制 SA-β-gal 的表达，且呈剂量依赖性（SA-β-gal 染色阳性细胞为蓝色）。

Wang Y N , Wu W , Chen H C , et al. Genistein protects against UVB-induced senescence-like characteristics in human dermal fibroblast by p66Shc down-regulation[J]. Journal of Dermatological ence, 2010, 58(1):19-27.

图7 UVB 照射诱导 HDFs 中 SA-β-gal 表达及染料木黄酮的保护作用

接下来，用不同浓度的染料木黄酮处理细胞24小时，ELISA检测 HDFs 细胞内 SOD 和 MDA 水平。实验发现即使在没有 UVB 照射的情况下，染料木黄酮处理仍能诱导 HDFs 中 SOD 活性并抑制细胞内 MDA 水平。

UVB 辐照导致细胞内 SOD 活性显著降低，同时细胞内 MDA 水平升高，说明 HDFs 对 UVB 的氧化应激反应增加。而加入不同浓度的染料木黄酮后，引起细胞内 SOD 活性的增加，在高剂量时 MDA 水平显著降低。

图8 不同浓度的染料木黄酮对成纤维细胞内SOD和MDA水平的影响

三维皮肤模型抗衰老功效评价

随着三维细胞培养技术的发展，三维人造皮肤模型可以在体外培养中模拟人体皮肤构造以及皮肤不同细胞间、细胞与细胞基质间的各种反应，使它更有效地应用于化妆品工业，对于快速筛选新型功效性原料具有实际意义。

在三维皮肤模型上评价抗皱剂等的功效性与单层细胞培养相比，更接近于生物体的真实状态，可以用于毒性分析和功效测试，是保证化妆品安全功效的重要手段。

实验时将活性物质配制成膏霜等剂型，涂于重建皮肤模型上，通过测试相关指标，如清除自由基能力、抗氧化能力和胶原蛋白含量，可以考察化妆品对细胞增殖分化及抗氧化能力的影响。

图9 3D皮肤模型的给药方式（来自博溪生物）

基于三维皮肤模型的抗衰老功效评价体系，可以分为抗表皮衰老和抗真皮衰老。两者可以通过构建不同的模型来实现更好的生物学指标响应。

比如表皮模型是由角质形成细胞构建形成，如下图所示。构建完成后，通过低剂量的UV照射连续照射进行干预，随后对组织形态、屏障相关指数等指标进行检测。

图10 体外重组表皮模型的工艺流程及评测指标

此外还可以通过构建全层皮肤模型进行真皮抗衰的评价。它的特点在于有真表皮结构，可以在体外进行细胞外基质含量变化的检测，从而进行抗衰老原料特别是化妆品成品的筛选。详情可点击链接《它为什么可以评估化妆品抗光损伤的效果？》

离体皮肤

离体皮肤的特点在于它天然而复杂组织构成：包括了天然表皮层和真皮层，真皮层中的纤维包括胶原纤维（95%）、弹力纤维和网状纤维等，这样的天然构成，使一体化地观测受试样品对皮肤的综合或者特定影响成为可能。

但是，离体皮肤难获取、难培养也使很多研究者望而却步。

目前博溪生物已经攻克了离体皮肤培养的问题，并应用离体皮肤来进行化妆品的功效评价。首先要解决的核心问题是“长程培养”的问题。目标是要让离体皮肤单元保持正常的生理活性，以满足各类检测、样品长时间暴露的需求，同时关注增殖与分化指标的平衡问题。

1 离体皮肤的培养

1）首先从临床取得捐献的离体皮肤组织，用皮肤取样器分割成一定大小的单元，用于后续研究；

2）对离体皮肤单元进行气液面培养，这是最为关键的步骤；在博溪生物的体系中，采用了自主开发的培养基来进行，这也得益于一直专注于皮肤模型开发的培养基技术的积累。

3）培养完成之后，收集离体皮肤单元，进行具体指标的检测。

图11 离体皮肤的培养流程

2 基于Exvivo的抗衰老评价体系

在光辐照的诱导下，皮肤细胞经历高水平、长期的氧化应激损伤；氧化应激和慢性炎症又进一步介导细胞外基质（ECM）的水平降低和细胞功能的老化；因此，我们在抗衰护肤品设计与评价中，可以从拮抗氧化应激、增加ECM合成、降低ECM降解、以及修复衰老细胞等角度入手。

图11 基于离体皮肤(ex vivo skin)的抗衰评价指标

3 案例展示：样品对离体皮肤(ex vivo skin)弹性纤维的影响

图12 免疫组化法检测样品对离体皮肤弹性纤维的影响（博溪生物）

结论：从IHC染色结果看，对照组真皮层内可见长束状弹性纤维，排列均匀、有序，UVR 照射处理后弹性纤维减少，排列稀疏、多呈断层式分布。阳性物质使用后，弹性纤维密度明显提升。

上述方法，汇总和梳理了基于体外细胞培养和模型建立的抗衰老功效评价方法，旨在针对不同的功效和评价需求,体外培养特定细胞或建立细胞损伤模型,使用目标成分刺激，观察细胞形态和毒性增殖等指标,通过分析特定基因通路、相关蛋白表达等分子生物学手段对原料或者成品进行功效评价。

由于体外细胞实验具有经济成本较低、实验周期较短、实验对象相对稳定且操作方法成熟等特点,应用细胞生物学方法建立体外培养皮肤细胞模型成为化妆品原料筛选和活性物质功效评价的主流方法之一。

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